Re: [求救] 抽pasmid的量都好少
※ 引述《shuo218 (快樂的理由)》之銘言：
: 最近在抽plasmid 因為我們實驗室是第一次接觸細菌的實驗
: 雖然照protocol下去做 可是抽完的濃度都少的可以
: 下面是我的protocol 還麻煩大家可以幫我解決這個問題
: 1 colony of successfully pGL-transformed E.Coli to 10ml prewarmed LB+ (in tube)
: Incubate o/n (16H) 37°C 60rpm
: 一次培養2管，然後將兩管倒在一起成20ml
: Centrifuge the 20ml culture at 10,000g x 5min
: 接下來的步驟都是照promega的protocol做的
: 不過最後我們是用40ul回溶 因為上次用100ul覺得量太少
: 結果今天做出來量更少 大概只有0.0125 ug/ul
: 實在不知道是哪邊出問題
: 因為後面要切 然後ligase 回收 再送到E.coli
: 可是前面的量就很少 後面好像根本就沒辦法做下去
: 大家有什麼好的方法嗎?謝謝!!
我不知道你的實際情形為何，
像我之前做過有點詭異的一次也是類似你的情形，
（我使用的是QUIGEN出的mini-prep）
一開始我以為會不會是該vector為low copy number
但應該不可能，因為該vector就是賣來做cloning的...
所以我想說就將養久一點...
並且狠了心給他放大兩次...
但結果同樣不好。
後來，
跟隔壁實驗室討論的結果，
想說有沒有可能因為我們拿這個vector並沒有用該公司所提供的菌種，
而是用我們自己實驗是的competent cell...
可能細胞不喜歡該vector...-_-"
因此該公司隨著kit賣的competent cell重新transform...
這次沒有放大、沒有加大LB量，
自然產量就很OK....
另外在操作的時候，
一些小動作也會影響（我認為啦）
像是學姐叫我說將細胞離心下來後，
先用殘留在試管的溶液將細胞resuspend，
再加上solution I，
但是我自己操作的時候則是將solution I加入後再與pallet一起resuspend...
至少測出來的OD就比學姐做的好多...-_-"
總之～good luck...
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