Re: [求救] cloning
※ 引述《sswweett (lalala)》之銘言：
: 想請教各位大大關於cloning的問題
: 我的insert是primer有設計RE的PCR product(1.2K)
: (用的是zero Blunt TOPO PCR cloning kit)
: vector 是5K
: 用2種RE分別切(SalI/PstI)insert 和 vector(O/N),
: 切完之後跑膠,進行gel extraction
應該跟長不長得出來沒關係,我們實驗室如果RE切下來的片段很小就直接
用DNA clean up耶~
: 以elution buffer回溶
: 接著進行ligation(> O/N 16度)
: Insert : Vector 莫耳數比試過 3:1 和 5:1
: DNA total 濃度試過 56 和 222 ng
: (用的是Takara T4 DNA ligase,也換過其他家廠牌)
會不會是ligation的效率太差?
我們在RE之後會再加phosphotase在vector裡~
成功率會提高!
: 最後進行transformation
: (用的是HIT compentent cell,也用過益生的 compentent cell)
: 我所選用的抗生素是chloramphenicol(試過20和30 μg/ml)
: 最後一顆菌也沒長 > <
: 我在想會不會是因為vector上2個切點太近的關係(就在隔壁)
: 所以事實上只切了一刀
: 不過因為這個vector是從別的實驗室取得的 而他們切都成功
: 似乎駁回我這個想法
: 不知道板上的大大有沒有什麼建議提供給我
: 已經過了2個月了 都一直沒有成功 > <
對於怎麼做就是成功不了這件事我也深有同感...
之前也發生過這樣的事 後來只好換primer(別的RE cutting site)
竟然可以@@ 或是先接到別的vector再切出來接進去(預計要的那個)
最後也還是找不到問題點在哪...只好換條路走~
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