Re: [求救] cloning
※ 引述《Adler (Adler)》之銘言：
: ※ 引述《cayumi (far away)》之銘言：
: : Promega的enzyme我沒用過 我只用過TAKARA 和Bio-lab(NEB)的enzyme
: : Promega的的T4 ligase 他本身附的是10X buffer
: : 他們公司另外有出一種 2X rapid ligation buffer,我是都用這個 ligation buffer
: : 我ligation的方法是 insert: 8μl
: : vector : 3μl
: : 2X buffer:12μl
: : ligase: 1μl
: : 置於16度c水浴槽(or 4度C)作用至少16個小時以上
: : 以heat-shock的方法做transformation
: : 我們家是用GeneMark的elution kit 個人認為滿好用的
: : 我plasmid都是用一般傳統的mini-preparation抽的
: : 可以踹看看用3%的gel(注意3%很容易就凝固了) 跑100V 40分鐘
: : 所以你vector有做CIP處理嚕!? CIP處理時間太久會影響到你ligation喔
: : 抗生素沒用錯吧 有看過很天兵的朋友用錯抗生素 == ==+
: : 這個我覺得有點怪怪的 應該只會出現single band吧,不應該有連續的band吧
: : 可是照理說用Kit抽應該不會有RNA的干擾才對,可以放張電泳圖嗎!?
: : 還有elution完後有load 1μl(怕太淡可以load 5μl)下去跑電泳check嗎!?
: : 不久前我們lab的學妹要把100bp左右的片段接到7 kb的vecor上
: : 我是敎她insert和vector都分別用NEB的enzyme做double digestion
: : 用100V跑3%gel 40分鐘,elution
: : ligation的條件就如上述所說的 做個兩次就出來了
: : 你在踹看看吧
: : 另外問一下,你用的切位是TA-vector本身的切位,還是你自己在primer上設計的切位!?
: 我是用我自己在primer設計的切位
那如果是這樣的話
你可以用含你的insert的plasmid(應該有定序過,確認序列無誤吧!?)當作 DNA template
用"好一點"的taq(ex:takara 的ex-taq)做pcr
primer就用你有設計切位的primer,總體積的話30-60μl皆可
pcr跑完之後,pcr product直接用1% gel去跑電泳,跑完之後做elute
elute完之後的product,下個10 or 20 μl去做digestion,之後再elute
雖說pcr可能會有base出錯的機會,但是若你taq用好一點,或是你用有pfu的taq
56bp應該是不太有機會出錯的
: ㄜ...我之前說的連續的band,是指它是一整片,由一百分佈至其下皆有
那就很怪啦
電泳圖應該是長成這樣子吧
marker
--- ----- vector
100bp ---
----- insert
一整片我覺會不會是RNase沒處理完全而殘留的RNA呀
你plasmid抽完之後load個1-5μ去跑電泳
如果100bp附近有亮成一片的話 那個應該都是RNA啦
: 可能造成你的誤會了... 抱歉..@@
: 切RE的gel我沒有照像耶...抱歉
: 我會用你的方法再試試的~^^ 謝謝你~
: ps.抱歉這麼晚才回...@@
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心一但開始動了，與沉靜便劃不上等號........
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