Re: [求救] cloning
※ 引述《cayumi (far away)》之銘言：
: ※ 引述《Adler (Adler)》之銘言：
: : 不好意思,之前寫得淺了
: : 我的insert只有51b.p. 要接在5kb的vector
: : vector為pET23a 已接有另一段約1.4kb的基因
: : insert已經接到另一TA vector上 為pTZ57R/T
: : 目前是用RE切出insert 由於plasmid的濃度高
: 所使用的enzyme是哪家公司的!? 又是哪一種enzyme!?
: digestion的方式是single digestion還是double digestion!?
: plasmid是用kit抽的還是用傳統的抽法!?
: : 所以在gel extraction前 可確定在約100b.p.附近有一粗亮的band
: gel是用幾%的!? elution kit是用哪家的!?(有的廠牌回收率不好)
: 51bp應該會在100bp之下吧 有辦法的話附個電泳圖會比較好
: : competent cell也已確定無問題
: ligase是用哪家的!? ligation的溫度和時間是!?
: 你是transformation之後沒長菌 還是長出來都是self-ligation!?
: 資訊多一點會比較好判斷哪裡出問題
: 我的經驗是insert越小的越好接
: 做cloning有時很運氣 有時隨便接隨便有 有時做到掛點都沒用
enzyme與ligase是用Promega的
elution kit是用Viogen的
plasmid也是用Viogen的midi kit抽
run plasmid 的gel為1% ; run insert的gel為2%
plasmid為single digestion
ligation的時間為4度 overnight
transformation後沒長菌
另外,insrt的band分布於100bp 其下亦有(連續的)
故才可確定內含insrt
謝謝~^^
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◆ From: 125.232.149.20
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