Re: [求救] cloning

看板Biotech (生命科學)作者Adler (Adler)時間19年前 (2007/02/12 20:58)推噓0(0推 0噓 1→)

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※ 引述《werthers6925 (...)》之銘言： : ※ 引述《philesazumi (苦悶阿)》之銘言： : : 1. 你如何判斷insert確實有切？ : : 2. insert如何來的？ : : 3. 有幾個control，兩個嗎？（有切，沒加ligase;有切，有加ligase） : : 4. 最後用相同的酵素切，如果你是要接入 MCS site : : 當然跟原本的vector差不多一樣大阿 : : 你要看有沒兩條band吧（4kb & 2.4kb）！！！ : : 5. 換不同切位，差異性大的（假設primer設計沒問題的話） : : 6. 先做TA，再sub- clon到你要的vector : 首先, 問的問題還是像前面一位一樣...請問...你的insert是怎麼來的?? : 第一, 如果是從其他plasmid上切下來....那你應該可以check酵素的作用能力如何 : 這應該比較沒問題............... : 第二, 如果你的insert是利用PCR的方式做出來.... : 那你的primer上應該會有加Not I, Nco I cut site : 請問在你這些cut site的5'端.....你是否有多加一些base?? : (比較保險是加4各base, 但不同的enzyme需要的base數目也不同) : 再來問vector的問題..... : 請問...你的vector是用哪一種的?? : NotI和NcoI是不是鄰近的倆各cut site?? : 你是否能確定你的vector作用很好?? : 由於你所提供的作法和資訊太少.... : 我們無法很精密地幫你找出問題的所在....只能靠猜測.... : 我想....應該不是你vector的問題..... : 主要原因應該在你的insert上.... : 如果可以的話...希望你能寫的詳細一點...方便大家討論.... 不好意思,之前寫得淺了我的insert只有51b.p. 要接在5kb的vector vector為pET23a 已接有另一段約1.4kb的基因 insert已經接到另一TA vector上為pTZ57R/T 目前是用RE切出insert 由於plasmid的濃度高所以在gel extraction前可確定在約100b.p.附近有一粗亮的band competent cell也已確定無問題 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 125.232.147.245