Re: [求救] cloning

看板Biotech (生命科學)作者Adler (Adler)時間18年前 (2007/02/27 18:06)推噓0(0推 0噓 0→)

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※ 引述《cayumi (far away)》之銘言： : ※ 引述《Adler (Adler)》之銘言： : : enzyme與ligase是用Promega的 : Promega的enzyme我沒用過我只用過TAKARA 和Bio-lab(NEB)的enzyme : Promega的的T4 ligase 他本身附的是10X buffer : 他們公司另外有出一種 2X rapid ligation buffer,我是都用這個 ligation buffer : 我ligation的方法是 insert: 8μl : vector : 3μl : 2X buffer:12μl : ligase: 1μl : 置於16度c水浴槽(or 4度C)作用至少16個小時以上 : 以heat-shock的方法做transformation : : elution kit是用Viogen的 : 我們家是用GeneMark的elution kit 個人認為滿好用的 : : plasmid也是用Viogen的midi kit抽 : 我plasmid都是用一般傳統的mini-preparation抽的 : : run plasmid 的gel為1% ; run insert的gel為2% : 可以踹看看用3%的gel(注意3%很容易就凝固了) 跑100V 40分鐘 : : plasmid為single digestion : 所以你vector有做CIP處理嚕!? CIP處理時間太久會影響到你ligation喔 : : ligation的時間為4度 overnight : : transformation後沒長菌 : 抗生素沒用錯吧有看過很天兵的朋友用錯抗生素 == ==+ : : 另外,insrt的band分布於100bp 其下亦有(連續的) : 這個我覺得有點怪怪的應該只會出現single band吧,不應該有連續的band吧 : 可是照理說用Kit抽應該不會有RNA的干擾才對,可以放張電泳圖嗎!? : 還有elution完後有load 1μl(怕太淡可以load 5μl)下去跑電泳check嗎!? : : 故才可確定內含insrt : : 謝謝~^^ : 不久前我們lab的學妹要把100bp左右的片段接到7 kb的vecor上 : 我是敎她insert和vector都分別用NEB的enzyme做double digestion : 用100V跑3%gel 40分鐘,elution : ligation的條件就如上述所說的做個兩次就出來了 : 你在踹看看吧 : 另外問一下,你用的切位是TA-vector本身的切位,還是你自己在primer上設計的切位!? 我是用我自己在primer設計的切位ㄜ...我之前說的連續的band,是指它是一整片,由一百分佈至其下皆有可能造成你的誤會了... 抱歉..@@ 切RE的gel我沒有照像耶...抱歉我會用你的方法再試試的~^^ 謝謝你~ ps.抱歉這麼晚才回...@@ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.129.77.1