Re: [求救] cloning

看板Biotech (生命科學)作者werthers6925 (...)時間19年前 (2007/02/12 13:10)推噓1(1推 0噓 0→)

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※ 引述《philesazumi (苦悶阿)》之銘言： : ※ 引述《willie0208 (我不要現在就出征....)》之銘言： : : 我有一段約4kb的vector要跟一段約2.4kb的insert接起來 : : 兩個plasmid兩端的切位分別用NotI和NcoI照理說應該很好接 : : 但是我做了兩三個月了~還沒做出來~ : : 問題到底出在那~塗盤後我的control組沒長(有加ligase怕自接) : : test組長個兩三顆~挑出來抽DNA後在去用相同的酵素切 : : 卻跟原本vector的DNA一樣大~ : : 到底是什麼原因???有大大可以救我嗎?? : 1. 你如何判斷insert確實有切？ : 2. insert如何來的？ : 3. 有幾個control，兩個嗎？（有切，沒加ligase;有切，有加ligase） : 4. 最後用相同的酵素切，如果你是要接入 MCS site : 當然跟原本的vector差不多一樣大阿 : 你要看有沒兩條band吧（4kb & 2.4kb）！！！ : 5. 換不同切位，差異性大的（假設primer設計沒問題的話） : 6. 先做TA，再sub- clon到你要的vector 首先, 問的問題還是像前面一位一樣...請問...你的insert是怎麼來的?? 第一, 如果是從其他plasmid上切下來....那你應該可以check酵素的作用能力如何這應該比較沒問題............... 第二, 如果你的insert是利用PCR的方式做出來.... 那你的primer上應該會有加Not I, Nco I cut site 請問在你這些cut site的5'端.....你是否有多加一些base?? (比較保險是加4各base, 但不同的enzyme需要的base數目也不同) 再來問vector的問題..... 請問...你的vector是用哪一種的?? NotI和NcoI是不是鄰近的倆各cut site?? 你是否能確定你的vector作用很好?? 由於你所提供的作法和資訊太少.... 我們無法很精密地幫你找出問題的所在....只能靠猜測.... 我想....應該不是你vector的問題..... 主要原因應該在你的insert上.... 如果可以的話...希望你能寫的詳細一點...方便大家討論.... -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.109.54.2