Re: [求救] cloning

看板Biotech (生命科學)作者cayumi (far away)時間18年前 (2007/02/25 01:28)推噓0(0推 0噓 0→)

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※ 引述《Adler (Adler)》之銘言： : ※ 引述《werthers6925 (...)》之銘言： : : 首先, 問的問題還是像前面一位一樣...請問...你的insert是怎麼來的?? : : 第一, 如果是從其他plasmid上切下來....那你應該可以check酵素的作用能力如何 : : 這應該比較沒問題............... : : 第二, 如果你的insert是利用PCR的方式做出來.... : : 那你的primer上應該會有加Not I, Nco I cut site : : 請問在你這些cut site的5'端.....你是否有多加一些base?? : : (比較保險是加4各base, 但不同的enzyme需要的base數目也不同) : : 再來問vector的問題..... : : 請問...你的vector是用哪一種的?? : : NotI和NcoI是不是鄰近的倆各cut site?? : : 你是否能確定你的vector作用很好?? : : 由於你所提供的作法和資訊太少.... : : 我們無法很精密地幫你找出問題的所在....只能靠猜測.... : : 我想....應該不是你vector的問題..... : : 主要原因應該在你的insert上.... : : 如果可以的話...希望你能寫的詳細一點...方便大家討論.... : 不好意思,之前寫得淺了 : 我的insert只有51b.p. 要接在5kb的vector : vector為pET23a 已接有另一段約1.4kb的基因 : insert已經接到另一TA vector上為pTZ57R/T : 目前是用RE切出insert 由於plasmid的濃度高所使用的enzyme是哪家公司的!? 又是哪一種enzyme!? digestion的方式是single digestion還是double digestion!? plasmid是用kit抽的還是用傳統的抽法!? : 所以在gel extraction前可確定在約100b.p.附近有一粗亮的band gel是用幾%的!? elution kit是用哪家的!?(有的廠牌回收率不好) 51bp應該會在100bp之下吧有辦法的話附個電泳圖會比較好 : competent cell也已確定無問題 ligase是用哪家的!? ligation的溫度和時間是!? 你是transformation之後沒長菌還是長出來都是self-ligation!? 資訊多一點會比較好判斷哪裡出問題我的經驗是insert越小的越好接做cloning有時很運氣有時隨便接隨便有有時做到掛點都沒用 -- 心一但開始動了，與沉靜便劃不上等號........ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.194.11