Re: [求救] cloning
看板Biotech (生命科學)作者Mouseking (叫我老鼠王....-_-)時間19年前 (2006/12/05 01:54)推噓0(0推 0噓 0→)留言0則, 0人參與討論串4/15 (看更多)
※ 引述《sswweett (lalala)》之銘言：
: 想請教各位大大關於cloning的問題
: 我的insert是primer有設計RE的PCR product(1.2K)
: (用的是zero Blunt TOPO PCR cloning kit)
不懂？zero blunt TOPO是幫助你五分鐘內接成blunt end PCR product....
你設計primer有RE何意？因為vector上有SalI/PstI sites嗎？
怎不用pfu作PCR直接用zero blunt TOPO vector接？
: vector 是5K
pCR-BluntII TOPO vector是3.5k吧？而且沒有salI site啊?
: 用2種RE分別切(SalI/PstI)insert 和 vector(O/N),
: 切完之後跑膠,進行gel extraction
: 以elution buffer回溶
: 接著進行ligation(> O/N 16度)
: Insert : Vector 莫耳數比試過 3:1 和 5:1
: DNA total 濃度試過 56 和 222 ng
: (用的是Takara T4 DNA ligase,也換過其他家廠牌)
: 最後進行transformation
TOPO比T4 ligase強很多
: (用的是HIT compentent cell,也用過益生的 compentent cell)
: 我所選用的抗生素是chloramphenicol(試過20和30 μg/ml)
pCR-BluntII TOPO vector不是kan?
: 最後一顆菌也沒長 > <
: 我在想會不會是因為vector上2個切點太近的關係(就在隔壁)
: 所以事實上只切了一刀
: 不過因為這個vector是從別的實驗室取得的 而他們切都成功
: 似乎駁回我這個想法
: 不知道板上的大大有沒有什麼建議提供給我
: 已經過了2個月了 都一直沒有成功 > <
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